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Forum 2: Alles außer Bestimmungsanfragen

Holotypus von Incurvaria brigantinella: Hintergrund-Infos zum Barcoding-Versuch

Hallo alle!

Ein paar Hintergrundinformationen zum Versuch, vom Incurvaria brigantinella Holotypus einen DNA-Barcode zu bekommen:

Es standen gerade noch Plätze in meiner Proben-Platte zur Verfügung (man braucht da immer 95 Proben!), die für Sequenzierung nach „degraded material protocol“ vorbereitet wurde. Wir verblieben so, dass wir die Sequenzierung des Holotypus auf jeden Fall erst einmal damit versuchen. Denn auch wenn sie fehlschlagen sollte, kann man immer noch einen zweiten Durchlauf mit NGS-Protokoll machen. Und ob der überhaupt sinnvoll ist, kann man nach dem ersten Durchlauf besser abschätzen.

Zum besseren Verständnis vorweg ein paar allgemeine Informationen:

Der DNA-Abbau setzt nach dem Tod der Zellen ein und schreitet unaufhaltsam voran, der DNA-Zustand ist also vom Alter der Probe abhängig, aber noch mehr von den Lagerbedingungen, wobei Feuchtigkeit besonders schlecht ist.

Für die Sequenzierung der Barcode-Region stehen unterschiedliche Verfahren („Protokolle“) zur Verfügung. Je nach dem erwarteten Erhaltungszustand der DNA wählt man unterschiedliche Protokolle, erwähnt seinen hier v.a. drei: das Basis-Protokoll, wo die ganze Länge von 658 Basenpaaren in einem Zug sequenziert wird (das kostengünstigste, erfordert aber guten Erhaltungszustand), dann „degraded material protocol“, dabei werden 2 etwa über die halbe Länge sich erstreckende Subsektionen getrennt sequenziert, und zuletzt „NGS-protocol“ („New Generation Sequencing“), wo zahlreiche kurze Subsektionen getrennt sequenziert werden. Letzteres ist das teuerste, aber es bringt auch bei schlechtem DNA-Erhaltungszustand oft noch brauchbare Ergebnisse, doch irgendwann ist natürlich auch dieses Verfahren an seiner Grenze.

Unabhängig von Protokoll wird jeder Abschnitt zwei mal sequenziert, nämlich jeder der beiden komplementären Stränge (der Hauptstrang „vorwärts“ = „forward“, der komplementäre Gegenstrang in die anderer Richtung, also „rückwärts“ = „reverse“). Das ergibt normalerweise 2 genau komplementäre Sequenzen. Wenn nicht, liegen Lesefehler vor, diese Positionen werden dann durch „n“ ersetzt. Die meisten „n“ sind freilich das Ergebnis ganz fehlender Signale.

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Vor kurzem kam das Ergebnis diese Platte, doch leider wurde die Sequenzierung der Incurvaria brigantinella als „failed“ (fehlgeschlagen) ausgewiesen.

„failed“ ist aber ganz und gar nicht gleich „failed“ - wie das?

In BOLD werden Sequenzen mit mehr als 6 unerkannt gebliebenen Basenpositionen (also mit mehr als 6 „n“) automatisch als „failed“ geführt. Aber wenn man einen BOLD-Account hat und gleichzeitig Zugang zu einer konkreten Probe, kann man sich die „trace files“ (tatsächliche Ergebnisse für alle Basenpositionen) ansehen, da sieht man viel mehr.

Als Beispiel die trace files der als „failed“ ausgewiesenen Sequenzierung eines Depressaria villosae- Paratypus. Es gibt zwar reichlich „n“, weit mehr als 6, aber doch auch eine passable Anzahl korrekt sequenzierter Basen (A = Adenen, T = Thymin, C = Cytosin, G = Guanin).

1. Abschnitt, reverse
nnCnnCTnnTTnCCnnnnATnnnnnnnnAnAAnTnnTnGnnnnnTACCCCCnnCTnnnnnnn
TTTTnATTTCnnGAAGAAnnnnGAAAAnnGnGCnGnnAGnGGATGAAnnnnnTnCCCCCC
CCnnnCnTnTAATATTGCCCAnGGAGGnAGAnCAGTAGAnnTAGATATTTTTTCCCnACnn
nnnGnGGGnnnnTnnTCnnTTTTAnGnGCAATTAnnnnTnTTnnTACAnTTnTTAnTAnAnG
AnTAAATAATATATCATTTGnTCAATTnCCnTTATTTGTATGAGCTGTAGGTATTACAGCATT
ATTAnTTnTATTATCCTTnTCnnTTTTAGCnGGAGnTnnTnnnATACTTnnnnnGATCGAAAT
TGCTTTCCCACGAATAAATAATAGTAACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnT

1. Abschnitt, forward
nnnnnnnnnnTnnnnnnnCnnnnnnnnnnnnnnTGATTTTTTGGAnATCCAGAAGTTTAAnnn
nnnnnGGnnnnnnnnATnCCCnnACnnTTCnTCnAATnnnGCCCnGGGAGGnnGAnnAnTA
nATTnAnCTATTTTTTCCCnnnnnTnnnCTGGnATTTCATCAnTTTTAnGnnCnnTTnnTTTnn
nnACAACnnnAAnnAATAnnCGAnTAAATAATATnTCATTTGAnCAnTTACCTTTATTTGTAn
GAnCTGnAGGnATTACAGCATTATTACTTCTATTATCCTTATCTGTTTTAGCnGGAGCTATTA
CTATACTTCTTACTGAnCGAAATTTAAATACnTCTTTTTTTGAnCnnGnGGGnnGAGGAnAn
CCAATTTnATAnCnnCnCTTATTTTGAnTTnnnGnACnnnnnnAAnnnnAAn

Diese erste Teilsequenz bringt, wenn man damit eine Bestimmungs-Abfrage („determination request“) macht, sogar einen Volltreffer. Hier musste der Beleg zwar nicht mittels Barcoding bestimmt werden, und in der Publikation, in der die Art beschrieben wurde, war so etwas nicht auswertbar. Aber wenn man einen nicht anders bestimmbaren Beleg hat, hilft das durchaus immer wieder, um zu einer Bestimmung zu kommen. Kommt gar nicht so selten vor bei offiziell als „failed“ ausgewiesenen Sequenzen.

Gleichzeitig sieht man ein auch immer wieder vorkommendes Problem, und zwar bei den trace files des zweiten Abschnittes.

2. Abschnitt, reverse
nTnTTnnnCCnnnCnnAAAGATATnGGAACnnnnnATTTTATTTTTGGAATTTGAGCnGGAA
TAGTAGGAACTTCATTnAGATTATTAATTCGAGCnGAATnGGGTAATCCnGGTTCTTTAATC
GGnGAnGnTCAAATTTATAATACTATTGTTACAGCTCnnGCTTTCATTATAATTTTTTTTATGG
TAATACCTATTATAATTGGAGGATTTGGTAATnGATTAGTACCnnTAATATTGGGAGCCCCn
GnnATAGCnTCCCnCGAAnAAAnAnnnAAnnnnnnnnnAACCAATCATnAAGATnTnnnnnn
nnnnnnnn

2. Abschnitt, forward
nnnnnnnnnnnnnnTnGGAnnGnnnnnnGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnAnTATTAATTCGnG
CnnnnTGGGTAATCCnGGnTCTTTAnTTGGAGATGATCAAATTTATAATAnTATTGTnAnnnC
nCAnGCnTTnnnnnAnTTTTTTTTAnnnnAAnACCnnTTAnAnTTGGGGGATTTGGnAAnTnn
nTTnnnCCCTTnAnATnGGGAGCCCCAnAAAnAGnTTTCCCCCnAAAAAAAAAAAAAAnTT
TTTTAnTTnnnCCCCCCCCTTCTTAnnnnTTTnnnTTTnAAAAAAAATnTnnAAAAAnGGGGn
nnnnnnnnnnnnAAAAAnAnnn

Die lange AAA.... Folge wirkte verdächtig, so was habe ich bei Depressarien noch nicht gesehen.. Tatsächlich bringt eine determination request auch nicht D. villosae als Top-Ergebnis, sondern eine Staublaus! Also bei mehr oder weniger schlecht aussehenden Sequenzen muss man durchaus damit rechnen, dass Verunreinigungen sequenziert wurden, Schimmelpilze sind da führend!

----------------------

Nun die trace files des Incurvaria brigantinella Holotypus im Detail

1. Abschnitt, reverse
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnTTTTnTnnnnnnnAnnnnnnnnnnnnnnCCnnnnTnnnnnnnnAnn
AAAAnnAnnTAAnnnnnnnnnnnCCnnnnnTnnnnnnGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnTnn
TnnnnnnnCnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnAGAnAnAAAnnnAnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnCnCnnnnn

1. Abschnitt, forward
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

2. Abschnitt, reverse
nnnnnnnnAnnnnnnnnnnTnGnGGnnnnnnnnnCCnnnnnnnnnTnnnnGnnGnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnAnnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

2. Abschnitt, forward
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnCnnnnAnnnnnnnnnnnnnnnAnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnTTnnnnnnAnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnAnnnnnnnnn
nnnnnnGnnnnnnnnnnnnAnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnAAnnAnnn

Man sieht sofort den Unterschied gegenüber dem Ergebnis der Depressaria villosae: hier ist fast gar nichts gegangen! Die Frage, ob NGS hier etwas bringen könnte, kann ich nicht einfach verneinen, so viel Erfahrung habe ich damit auch nicht. Einen Versuch mag es allemal wert sein, die eine oder andere Subsektion (die bei NGS viel kürzer sind) könnte ja schon rauskommen. Aber die Chancen stehen schlecht, somit haben wir übereinstimmend befunden, die Veröffentlichung der Synonymie deswegen nicht mehr weiter zu verzögern.

Schöne Grüße, Peter

Beiträge zu diesem Thema

Verschollener Holotypus von Incurvaria brigantinella Amsel, 1961 aufgetaucht *Foto* Bestimmungshilfe
Alles sehr seemännisch ;)
Korrektur zur Abbildung des Belegfalters
Was ist Incurvaria brigantinella AMSEL, 1961? Jetzt gibt es ein Ergebnis. *Foto* Bestimmungshilfe
Was sind denn das für Teile des Genitals?
Link zu mothdissection.co.uk
Unsere BH enthält eine (Teil-)Antwort!
Danke, Jürgen, damit komme ich zurecht. VG. Hartmuth *kein Text*
Holotypus von Incurvaria brigantinella: Hintergrund-Infos zum Barcoding-Versuch
Hintergrund-Infos zum Barcoding-Versuch - danke, Peter - viele Grüße, E.R. *kein Text*